培养基倾注的温度与厚度是实验正确与否的关键。（倾注的温度：一般35~45℃，温度过高会造成已受损伤的菌细胞死亡。厚度：直径9cm的平皿一般要求15~20mL培养基，若培养基太薄，在培养过程中可能因水分蒸发而影响细菌的生长）。

 

为防止细菌增殖及产生片状菌落，在加入样液后，应在15min内倾注培养基。检样与培养基混匀时，可先向一个方向旋转，然后再向相反方向旋转。旋转中应防止混合物溅到皿边的上方。

 

l培养基凝固后，应在尽快将平皿翻转培养，保持琼脂表面干燥，尽量避免菌落蔓延生长，影响计数。

 

l为控制污染，在实验过程中，应在工作台上打开一块琼脂平板，其暴露时间应与检样从制备、稀释到加入平皿时所暴露的最长时间相当，然后与检样一同培养，以了解检样在操作过程中有无受到来自外界的污染。培养温度:每种不同样品中的细菌都有一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件及生理条件可能得出不同的结果，因而应根据检测标准的要求选择适当的培养温度和培养时间。

 

l食品：36±１℃，48±2h 。

 

l饮用水：36±１℃，48h 。

 

l水产品：30±１℃，72±3h。(36℃培养和30℃培养结果差别较大，同样水产品48h结果和72h也有差别。

 

对照试验：

 

l检样的稀释液中往往带有食品颗粒，在这种情况下，为避免与细菌菌落混淆，可作一检样对照，不经培养，置4℃环境放置，在计数时用于对照。

 

l或可选用TTC营养琼脂作培养基。

 

菌落计数：

 

l如果高稀释度平板上的菌落数比低稀释度平板上的菌落数高，则说明检验过程中可能出现差错或样品中含抑菌物质，这样的结果不可用于结果报告。

 

l如果平板上出现链状菌落，菌落间没有明显的界限，这可能是琼脂与检样混匀时，一个细菌块被分散所造成的。一条链作为一个菌落计。若培养过程中遭遇昆虫侵入，在昆虫爬行过的地方也会出现链状菌落，也不应分开计数。

 

l如果平板上菌落太多，不能计数时，不能用多不可计作报告。应在最高稀释度平板上任意选取2个1cm2的面积，计算菌落数，除2求出每cm2面积内平均菌落数，乘以63.6(皿底面积cm2数)。

 

l如果检样是微生物类制剂（酸牛奶、酵母制酸性饮料等），在进行菌落计数时应将有关微生物（乳酸菌、酵母菌）排除，不可并入检样的菌落总数内作报告。 每个样品从开始稀释到倾注最后一个平板的时间不得超过15min,目的是为了使菌落能在平板上均匀分布，否则，时间放长了，样液可能由于干燥而贴在平板上，倾注琼脂后不易摇开，容易产生片状菌落，影响菌落计数。另外，琼脂凝固后不要在室温长时间放置，应及时将平皿倒置培养，可避免菌落的蔓延生长。

 

检验过程中应用稀释液做空白对照，用以判定稀释液、培养基、平皿或吸管可能存在的污染。同时，检验过程中应在工作台上打开一块空白的平板计数琼脂，其暴露时间应与检验时间相当，以了解检样在检验过程中有无受到来自空气的污染。

 

检样稀释液有时带有食品颗粒，为避免与细菌发生混淆，可以作一检样稀释液与平板计数琼脂混合的平皿，不经培养，于4℃冰箱放置，以便在计数时用作对照。另外也可以在已熔化而保温在45℃水浴内的平板计数琼脂中，按100ml加1ml0.5%氯化三苯四氮唑（TTC）水溶液，培养后食品颗粒不变色，细菌为红色。